Archive

Archive for Октябрь, 2010

Электрофороз биополимеров

Попытки деления смесей частиц с помощью электрофореза предпринимали с начала ХХ в. В основу их направленной, катодной или анодной подвижности, легли соответственно, отрицательный или положительный знак и целочисленные величины зарядов. К середине века, аппарат Тизелиуса стал основой электрофореза смесей белков. Он состоял из блока питания постоянного тока, стеклянной камеры с электродами, заполненной буферным раствором и довольно сложной оптики для визуальных наблюдений за делением фракций. Таким образом, вторым фактором деления смесей при свободном электрофорезе в растворе, стали величины рН и ионной силы буфера, изменяющие степень ионизации белков. Так, выбор стандартного рН 8,6 буферного раствора для белков сыворотки крови вызван тем, что в этом случае, все их фракции имеют катодную подвижность. К сожалению, приборы этой конструкции, имели ряд неустранимых недостатков, начиная с хрупкости и низкой разрешающей способности и, кончая высокой стоимостью.

В 1950 г. Durrum et al. предложили вести электрофорез белков сыворотки крови на полосках фильтровальной бумаги, пропитанных буфером. Этот тип электрофореза назвали зональным или зонным, т.к. поддержка среды-носителя ограничила диффузию компонентов смеси. Таким образом, свойства зоны, в качестве которой применяют хроматографическую бумагу, ацетилцеллюлозу, водные гели крахмала, агарозы и полиакриламида = ПАГ, стали третьим фактором деления смесей линейных биополимеров. Наконец, замена: стекла на пластиковые камеры разных конструкций и оптических систем прямого наблюдения на сравнительно простые вспомогательные приемы, резко удешевили конструкцию приборов, стандартизовав основные процедуры метода.

Таким образом, любой современный прибор для зонного электрофореза, как минимум включает в себя блок питания постоянного тока, обычно до 500 В и электрофоретическую камеру принципиально разных конструкций, зависящих от свойств зоны и выбора горизонтального, вертикального или других вариантов метода. До сих пор справедливо утверждение, что электрофорез – в основном аналитический метод.

Гель-хроматография

Принцип метода: Разделение смесей этим способом основано с одной стороны, на различиях в размерах их молекул, а с другой — на соизмеримости разделяемых молекул с размерами пор гранул гелей. Поэтому крупные макромолекулы в поры геля не проникают и элюируются с колонок первыми. Напротив, чем мельче размеры молекул других компонентов смеси, тем чаще они попадают через поры в гранулы и, задерживаясь в колонке, выходят из нее позже, то есть в больших объемах элюата. Отсюда синонимы метода: гель-фильтрация или метод молекулярных сит.

Свойства молекулярных сит имеют многие пористые материалы, начиная с природных или искусственных цеолитов, полиакриламида и пористого стекла, несжимаемых при гидростатическом давлении. Напротив, трехмерные гели агарозы и декстрана (коммерческие названия Сефадекс – Pharmacia, Швеция; Молселект – Reanal, Венгрия), благодаря высокому содержанию гидроксильных групп легко набухают, но и сжимаются при избытке давления или скорости истечения элюата, что нежелательно, во избежание регенерации колонки! Как правило, большие марки препаратов, идущих за их названием, отражают большую степень набухаемости и более крупный размер гранул, при меньшей степени их поперечной сшитости, позволяющих разделять вещества в широком диапазоне молекулярных масс.

Методы хроматографии

Известно, что основоположник хроматографии М. С. Цвет (1872 – 1919) разделил экстракт пигментов растений (1903) по их сорбции на колонке каолина = белой глины. Т.к. в потоке элюента = жидкости, фильтрующейся через носитель, скорости движения компонентов разделяемых смесей обратны степени их сорбции, Arne Tiselius (1902 – 1971, Швеция) предложил термин «сорбционный анализ» и, стал делить смеси, в зависимости от времени прохождения элюента через колонку или тонкий слой сорбента с развитой поверхностью.

При плоскостных методах, 1-10 мкл смеси разделяемых веществ наносят на бумагу или тонкий слой сорбента, закрепленный на стекле или фольге. Носитель помещают во влажную, чаще стеклянную камеру с элюентом — смесью двух частично смешивающихся жидкостей. За десятки минут элюент перемещается по сорбенту под действием капиллярных сил и гравитации. При этом одна из жидкостей фиксируется на сорбенте, образуя неподвижную фазу, а другая – подвижная, проходит по нему с большей скоростью. В соответствии со степенью растворимости в той или иной части элюента, компоненты смеси распределяются по хроматограмме.

Независимо от принципа деления компонентов, колоночная хроматография возможна вручную, но гораздо удобней специальные приборы – хроматографы. Обычно, при помощи насоса на вход их колонок подают, как разделяемую смесь, так и элюент. А на выходе – размещают детектор, который, независимо от конструкции, в автоматическом режиме непрерывно отражает на диаграмме регистрации = хроматограмме, время выхода и концентрации компонентов в элюате. Варианты колоночной хроматографии (рис. 8.1) отличаются друг от друга не так диаметром, длиной колонки и типом носителя, как очередностью подачи в нее элюента и разделяемой смеси. Преимущество проявительной хроматографии состоит в том, что колонка не требует регенерации, а зоны компонентов анализируемой смеси – разделяются слоями элюата.

В соответствии с агрегатным состоянием подвижной фазы, различают газо-жидкостную = ГЖХ и жидкостную хроматографию. Последняя – наиболее разнообразна, т.к. включает в себя фильтрацию в гелях, аффинную и высокоэффективную жидкостную хроматографию = ВЭЖХ, больше известную как HPLC = High pressure liquid chromatography, то есть хроматография под давлением. Т.о., все разнообразие методов хроматографии, как совокупности научных и производственных технологий в разных областях химии, медицины, экологии и т.д., основано на различиях в скоростях движения концентрационных зон компонентов изучаемых смесей, смещающихся относительно сорбента в потоке подвижной фазы.


Качественный и количественный анализ

Известно, что качественный анализ основан на органолептических свойствах выявляемых компонентов, исходя из которых различают: внешний вид и запах вещества, выделение пузырьков газа, изменения цвета = цветные реакции, появление осадков в растворе = осадочные реакции, звуковой сигнал металлодетектора, изменения цвета пламени и т.п. Его классический пример – закрепившийся в органической химии способ описания веществ, начиная с их внешнего вида и физических свойств. Техническая простота и Экспрессность качественного анализа, часто допускают его применение как в лабораториях, так и на месте (on site), то есть в быту и полевых условиях. Примером этого, может быть оценка качества шерсти по запаху серы подожженной нити.

Простые и дешевые приемы качественного анализа образцов в сжатые сроки, без предварительной подготовки проб, легли в основу методологии массового скрининга = просеивания (screen, англ. – сито). Такая экспресс-оценка полезна не только при металлодетекции, но и для выявления наследственных болезней у новорожденных, изучения токсичности и экологической безопасности образцов атмосферы, почв, воды, пищевых продуктов, косметики, бытовых изделий и т.д. Методы скрининга должны полностью исключать отрицательные результаты химико-биологических тестов, которые считают окончательными без дополнительной проверки. Напротив, все пробы с положительной реакцией, в т.ч. и ложноположительной, изучают далее, с помощью более информативных методов количественного анализа.

Количественный анализ гораздо более трудоемок, так как связан с правильным выполнением технически громоздких операций подготовки образцов, применением мерной посуды, аналитических весов, рН-метров, фотометров и других сложных и сравнительно дорогих приборов. Понятно, что все эти требования выполнимы, лишь при наличии квалифицированного персонала и условий стационарной лаборатории. Тем не менее, в настоящее время, до 90 % полезной информации в экологической, медико-санитарной, сельскохозяйственной и судебной диагностке, получают с помощью аппаратурных методов количественного анализа. Часть этих методик осваивается при дальнейшем прохождении курса.

Меньше известен, издавна популярный в медико-биологических науках, полуколичественный анализ. Как и количественный, он основан на какой-либо качественной реакции, интенсивность которой пропорциональна содержанию искомого вещества. Как правило, он не позволяет оценить его абсолютное содержание, но, наличие или возможность самостоятельного построения шкалы сравнений, делают этот способ технически приемлемым, относительно экспрессным и довольно экономичным, позволяя быстро оценивать серии образцов по принципу больше/меньше. Простейший пример полуколичественного анализа – универсальная индикаторная бумага, позволяющая быстро и просто получить примерный ответ о величине рН исследуемого раствора.

Растворы: типы и области применения.

Известно, что системы с концентрационным преобладанием одного из компонентов называют растворами. Исходя из конкретных свойств, важных в данное время, их рассматривают с разных позиций (рис. 1). Если термин употребляют без уточнений, обычно имеют в виду жидкие растворы, и т.к. из всех жидкостей, на Земле и в биосфере преобладает вода, то чаще всего в быту, технике и биологии встречаются водные растворы веществ.

растворы

Независимо от способа получения, природа растворенных веществ прямо определяет размер частиц и степень гомогенности раствора, его оптические и кинетические свойства. При этом, степень склонности веществ к электролитической диссоциации, соответственно сохраняет или повышает количество частиц в растворе. В последнем случае, ионы разных знаков обеспечивают раствору новое свойство электропроводности. Наконец, часть, не менее чем трехкомпонентных систем электролитов, способных поддерживать постоянство рН при добавлении сильных кислот или оснований, называют буферными растворами.

При полуколичественных оценках концентрации пользуются терминами: разбавленный, насыщенный = рассол или пересыщенный растворы. К большинству водных растворов применимы правила:

1. В 1 мл – 20 капель, то есть объем капли ~50 мкл.

2. Объем чайной ложки – 5 мл, десертной – 10 мл, столовой – 15 мл.

При количественном подходе, обычно используют массовые, молярные или объемные доли вещества, относительно общего количества системы. Согласно Международной системе единиц (СИ), допустимы лишь массовые (г/м3) и молярные (моль/м3) концентрации и их производные. Но, в обиходе, они слишком велики, трудоемки и неудобны, так как требуют пересчетов, специального оборудования и навыков работы. Поэтому, во всех допустимых случаях лабораторной и фармацевтической практики, применяют технически более простые и удобные объемные доли: г/л, ммоль/л, г/дл, мг/мл и т.п. При титриметрии пользуются более редкими величинами выражения концентраций: «титр» и «нормальность» (н.), отражающими, соответственно, количество граммов растворенного вещества в 1 мл или число химических эквивалентов растворенного электролита в 1 л. раствора. В быту и технике часто приемлемы более грубые, но технически простые и быстрые приемы выражения концентраций в процентах (%) или промилле (‰), соответственно массовой или объемной доле на 100 или 1000 мл раствора. Наконец в гомеопатии, концентрации растворов часто выражают долями на млн-1, трлн-1 и т.д., вплоть до числа Авогадро.

Промышленные выбросы и фотосинтез

Фотосинтез является одним из наиболее чувствительных процессов к внешним условиям, в том числе, к состоянию атмосферного воздуха. Торможение фотосинтетической деятельности ассимиляционных органов, независимо от вызвавшего ее фактора, выступает причиной нарушения общего обмена веществ в организме, сокращается его автотрофное питание и отложение запасных веществ. Конечным результатом подавления фотосинтеза является снижение интенсивности роста, развития, образования биомассы и хозяйственного урожая растений, а также устойчивости к другим неблагоприятным факторам. Обобщение экспериментальных данных позволяет сформулировать некоторые общие положения, характеризующие зависимость изменения фотосинтетической функции растений от действия токсических газов:

1.          Низкие концентрации токсических газов вызывают медленное снижение фотосинтеза растений соответственно скорости накопления их в листьях, без образования на листовых пластинках видимых признаков повреждения. После прекращения газации фотосинтез таких растений восстанавливается до уровня незагазованных особей того же вида;

2.          Токсические газы в концентрации, вызывающей образование некротических пятен на листьях подавляют фотосинтетическую функцию листьев тем сильнее, чем большая площадь пораженных участков;

3.          При видимом повреждении менее 20%  общей площади листовых пластинок фотосинтетическая активность оставшихся здоровыми участков листьев через некоторый период после прекращения газации выше, чем у незагазованных растений, в расчете на единицу площади. При образовании некротических участков на большей площади листьев или высоком уровне накопления в них токсических соединений наступившее во время газации торможение фотосинтеза сохраняется длительное время и обычно не восстанавливается до нормального уровня;

4.          Высокие концентрации токсических газов в воздухе мгновенно или через несколько минут после начала газации полностью подавляют фотосинтез растений. Кратковременное пребывание растений в такой атмосфере не всегда сопровождается образованием на листьях некротических пятен.

Перечисленные взаимосвязи и взаимообусловленности степени нарушения фотосинтетической деятельности растений от химического состава и концентрации действующих газов проявляются неоднозначно у разных видов и в зависимости от условий их выращивания и газации.

Общим для всех растений является то, что с повышением общей устойчивости необходима большая концентрация или более продолжительное действие атмосферных токсикантов для того, чтобы вызвать начальное торможение их фотосинтеза. Неглубокое и кратковременное подавление фотосинтеза растений легко восстанавливается до прежнего уровня.

С усилением депрессии фотосинтеза и появлением обесцвеченных участков на листовых пластинках для регенерации требуется 5-10 дней. В этом случае фотосинтетическая активность оставшихся неповрежденными участков листовых пластинок нередко выше, чем у незагазированных растений. Такое явление отмечено через несколько дней после окончания искусственной газации растений.

Следует полагать, что сокращение площади ассимиляционного аппарата растений химическими факторами, которые наблюдаются в загрязненной атмосфере, вызывают сходную ответную реакцию растительного организма. Она направлена на восстановление нарушенных систем и функциональной координации между органами растений путем усиления синтеза ассимилятов. Это достигается продолжающимся функционированием корневой системы, которая обеспечивает оставшиеся здоровыми участки листьев относительно большим количеством минеральных и синтезированных в них веществ.

Растения и тяжелые металлы

Не менее вредным для растений является накопление в них тяжелых металлов. К ним относятся химические элементы с атомной массой свыше 50, обладающие свойствами металлов металлоидов. К очень токсичным отнесены следующие: кобальт, железо, медь, свинец, олово, марганец, магний. Некоторые из них являются микроэлементами и необходимы для живых организмов. В сложном процессе химической и биологической эволюции для живых организмов стали необходимы все без исключения химические элементы. Поэтому правильнее говорить не о токсичных элементах, а о токсичных концентрациях тяжелых металлов для живых организмов.

Основными источниками загрязнения тяжелыми металлами являются металлургические предприятия, автотранспорт, электростанции, сжигающие уголь. В атмосфере большинство тяжелых металлов встречается в виде твердых частиц, адсорбированных на других частицах или в виде солей.

Попавшие в почву тяжелые металлы закрепляются гумусовым веществом, образовывая соли с органическими кислотами и т.д. Именно этим обстоятельством в значительной мере объясняется повышенное содержание тяжелых металлов в верхнем слое почвы. Увеличение содержания тяжелых металлов в почве ведет к возрастанию их концентрации в растениях. Растительные организмы при избытке тяжелых металлов ведут себя по-разному, но все они в состоянии в большей или меньшей степени от него защищаться. Важную роль в защите растений от избытка поступающих из почвы тяжелых металлов выполняет корневая система. Задерживая избыточные ионы, корни тем самым способствуют сохранению в надземных органах благоприятных (или невредных) концентраций химических элементов.

В результате поглотительной деятельности растений происходит накопление в них вредных веществ, в том числе и тяжелых металлов. В промышленном районе концентрация свинца в растениях возрастает в 4-8 раз по сравнению с пригородным. Таким образом, растения очищают городской воздух от свинца. Fe, Sr, Mn, Zn, Cu и другие тяжелые металлы также способны накапливаться в растениях промышленных районов. Содержание их в 2-9 раз у растений в городах выше, чем в сельской местности. Предполагают, что поступающие в растительный организм тяжелые металлы локализуются в пузырьках диктиосом и откладываются в клеточной оболочке.

Тяжелые металлы оказывают отрицательное влияние на жизнедеятельность растений. Избыточное поступление тяжелых металлов в живые организмы нарушает процессы метаболизма, тормозит рост и развитие.

Виды повреждений растений промышленными газами

Различают две группы  повреждений токсическими газами: видимые и скрытые. Внешние признаки повреждения деревьев и кустарников носят разный характер – от изменения окраски, некрозов, ассимиляционных органов до преждевременного листопада, недоразвития побегов, суховершинности и полной гибели растений. Скрытые повреждения проявляются в снижении продуктивности за счет ингибирования фотосинтеза, изменений метаболизма, ускорения старения, увеличения восприимчивости к болезням и вредителям. Стадия структурных нарушений проявляется, когда экологические и физиологические признаки достигают одинаковых отклонений.

Наибольшую опасность для растений представляют сернистый ангидрит, соединения фтора, хлористый водород, окислы азота, пылевидные частицы, содержащие адсорбированные окислы различных металлов.

Исследования разных авторов позволили расположить кислые газы в следующий ряд по мере убывания их фитотоксичности: фтор, хлор, двуокись серы, окись азота, окись углерода, двуокись углерода. Токсическое действие загрязнителей атмосферы на растения может варьировать в широких пределах в зависимости от концентрации и продолжительности действия газа, видовой специфики растений, стадии онтогенеза и условий окружающей среды. Растительные организмы очень чутко реагируют на изменения состава воздуха. На состоянии растений отражаются концентрации существенно меньше ПДК.

Например, повышение уровня загрязнения воздуха сернистым газом до концентрации в 10 раз меньше чем ПДК вызывает хроническое или кратковременное поражение листьев растений, замедление роста зеленой массы и снижение урожайности.

Длительное поглощение SO2  способствует накоплению сульфата до летальных доз, приводящих к появлению некрозов. В городских условиях изменяется структура, форма и размеры кроны, увеличивается ее прозрачность. Строение листа у деревьев по мере увеличения напряженности городской среды изменяется в сторону ксероморфоза.

Не менее вредным для растений является накопление в них тяжелых металлов. К ним относятся химические элементы с атомной массой свыше 50, обладающие свойствами металлов металлоидов. К очень токсичным отнесены следующие: кобальт, железо, медь, свинец, олово, марганец, магний. Некоторые из них являются микроэлементами и необходимы для живых организмов. В сложном процессе химической и биологической эволюции для живых организмов стали необходимы все без исключения химические элементы. Поэтому правильнее говорить не о токсичных элементах, а о токсичных концентрациях тяжелых металлов для живых организмов.

Особенности повреждающего воздействия промышленных выбросов на растения

Загрязненный атмосферный воздух является серьезным экологическим фактором, который оказывает глубокое влияние на структуру и функции древесно-кустарниковых насаждений и естественных лесных массивов.

Поэтому внешний вид крон древесно-кустарниковых насаждений дает относительно ясное представление о сопротивляемости и устойчивости насаждений, а также о степени повреждения.

Для определения степени повреждения были разработаны многочисленные методы: химические, ботанические (фитоиндикаторы), лесоводческие методы (сравнительные данные о состоянии посадок – внешнего вида кроны, степени облысения, прироста, а также исследования продуктивности насаждений), физиолого-биохимические и другие.

Постоянно меняющиеся действия смены направления ветра и др факторов, а также различная в течении дня и года восприимчивость растений объясняют появление хронических и острых признаков повреждений в тех же самых насаждениях или на том же самом растении.

При хроническом повреждении на маленьком участке можно получить хорошие результаты. Но крупные повреждения из-за большой изменчивости, обусловленной различиями индивидуумов, пород, мест произрастания, вегетативных стадий с помощью листового анализа точно разграничить по зонам невозможно. При остром кратковременном воздействии вредных веществ листовой анализ вообще ошибочен, т.к. органы ассимиляции настолько быстро отмирают, что они даже не могут поглотить токсическое вещество.

Термин «повреждение» включает все реакции растения, обусловленные загрязнением атмосферы; обратимые изменения метаболизма; уменьшение интенсивности фотосинтеза, некроз листьев, преждевременный листопад или подавление роста. Эти реакции начинаются с нарушения биохимических процессов и микроскопических, субмикроскопических изменений в клеточных органеллах, обнаруживаются затем в изменении морфологической картины и общего состояния и, наконец, проявляется в целом замедлении роста, ухудшением внешнего вида или даже гибелью растения.

Накопление в органах растений и проявление повреждающего действия токсических газообразных веществ является сложным и многоступенчатым процессом, зависящим от индивидуальных свойств организма и внешних условий. Его можно представить в виде нескольких последовательных этапов: поступление газообразных веществ в листья и другие органы, взаимодействие фототоксикантов с клеточными компонентами и органеллами, отток токсических веществ из мест поглощения в другие ткани или вымывание водой и нарушение функции и структуры клеточных органелл, тканей и организма в целом. Степень повреждения листьев и других органов растения в каждом конкретном случае определяется соотношением двух противоположно направленных процессов: скорости поступления токсических веществ внутрь ткани листа или другого органа и полноты нейтрализации, обезвреживания или включения в метаболизм без нарушения функции и структуры клеточных систем и коррелятивных связей между органами растения.

Газоустойчивость растений

Промышленные выбросы – это специфический антропогенный фактор, исторически действующий не очень продолжительное время. У растений отсутствуют эволюционные приспособления к действию газов. Следовательно, газоустойчивость должна базироваться только на тех свойствах, которыми они располагают в естественной среде, то есть они имеют определенную «преадаптивность».

Способность растений противостоять действию вредных газов, сохраняя нормальный рост, развитие и декоративность называется газоустойчивостью. Однако газоустойчивость различных видов деревьев и кустарников не одинакова.

При создании городских насаждений необходим подбор газоустойчивого ассортимента. Некоторые виды растений могут переносить без заметного ущерба для себя в 5-10 раз большую концентрацию вредных газов по сравнению с др. Подбор видового ассортимента растений местной флоры является наиболее действенным моментом в деле создания устойчивых зеленых насаждений, эффективно отфильтровывающих воздух от вредных газов. Газоустойчивые виды характеризуются большей длительностью вегетации, медленным развитием, коротким позднелетним периодом цветения, анатомо-морфологическими особенностями, позволяющими сокращать газообмен и скорость поглощения газов, большей экологической пластичностью, способностью значительно уменьшать степень открытия устьиц, уменьшая тем самым возможность проникновения газа в мезофилл, низкой интенсивностью и сравнительно высокой обводненностью листьев.

В условиях повышенной загазованности воздуха выживают лишь те виды или популяции растений, которые имеют сформированные преадаптивные приспособления к другим неблагоприятным факторам среды.