Archive

Posts Tagged ‘Методы’

История развития методологии белков

До 70-х гг. прошлого века, наиболее точным (10-5 г/л), считалось определение белка по количеству азота. Исходя из того, что в подавляющем большинстве белков, за исключением гистонов и протаминов, содержание азота близко к 16 %, считалось достаточным умножить найденную величину на эмпирический коэффициент 6,25 и, получить содержание белка в препарате. Однако, необходимость минерализации препарата в серной кислоте и последующее определение аммиака, занимали часы-сутки. Из-за длительности и трудоемкости этих процедур, сейчас этот метод применяют редко. По близким причинам, измерение концентраций белка на основе анализа аминокислот, используют лишь в специализированных лабораториях.

С 50-х гг. ХХ в., чаще всего в биохимической литературе цитировали работу Lowry и соавторов, предложивших измерять концентрации белков сочетанием биуретовой реакции с реактивом Фолина-Чиокалто (1927), дающим интенсивную темно-синюю окраску с тирозином, фенилаланином и, меньше с такими аминокислотами, как Три, Гис, Цис. К сожалению, его линейность, сохраняется лишь в узком диапазоне концентраций. Большинство модификаций этой методики сводится к попыткам устранить влияние специфических реагентов, применявшихся при выделении белков. В последние годы появились методы связывания красителей и флуорометрии, если в белке имеется, или, без потери нативных свойств, в него вводится соответствующий маркер.

Классификация мктодов определения белка в биологической жидкости

Известно, что белки составляют половину и более сухой массы большинства клеток. Пластичность их полипептидной структуры позволяет белкам играть роль главных «молекулярных машин» в любой клетке и организме. Наконец белки – важнейший источник азота в питании, а, следовательно, росте и развитии консументов. Поэтому определение белка играет первичную = опорную роль во всех количественных исследованиях по энзимологии и биологии клеток, служит основой оценки физиологии и патологии организмов и их популяций, а также – важнейшим критерием оценки качества = эффективности пищевых цепей.

Соответственно задачам и возможностям лабораторий, методы измерения концентрации белков многочисленны и разнообразны. Очевидно, что рефрактометрия (лат. Refractus – преломление) позволяет быстро и просто определять процентные концентрации белка в двухкомпонентных растворах. Гравиметрия – зависит от чувствительности лабораторных весов и требует чистого препарата, высушенного до постоянной массы.

Методы измерения концентрации белков:

1.Непрямые:1)определение азота,2)аминокислотный анализ,3)метод Лоури,4)Флуорометия и сорбция красителей.

2. Прямые:1) рефрактометрия,2) гравиметрия,3) спектрофотометрия,4) Биуретовый.

Фотоспектрометрия

Фотометрический анализ – совокупность методов качественного и количественного анализа по интенсивности УФ, видимого и ИК излучений. Но, т.к. биообъекты на 2/3 состоят из воды, высокая теплоемкость которой поглощает ИК лучи, то в биологии их почти не применяют, широко используя 2 других диапазона

Нередко фотометрию сводят к молекулярно-абсорбционному анализу, основанному на объединенном законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера. Согласно ему, в стандартных условиях кюветного отделения и длины волны, перпендикулярной толщине слоя однородной среды (l), между концентрацией (С) поглощающего вещества и соотношением интенсивностей исходного = Ф0 и достигшего детектора = Ф1 потоков излучений, возникает логарифмическая зависимость: С = lg Ф01. Отсюда появился не очень точный, но распространенный синоним – концентрационный анализ.

При стандартных λ и толщине образца, количество света достигшее фотодетектора выражают линейной шкалой светопропускания = Т (transition), которую для удобства в работе, обычно градуируют в %. К сожалению, она не имеет прямого отношения к свойствам образца, ослабляющего интенсивность излучений за счет поглощения = А (absorbtion) или, таких устаревших понятий, как оптическая плотность = D (density) раствора и коэффициент его экстинкции = Е. С другой стороны, зависимость 2 – lg T = А, обеспечивает высокую точность измерения концентраций в диапазоне 0,2-0,8 безразмерной логарифмической шкалы от 0 до ∞.

Во избежание оптических эффектов, способных исказить результаты, фотометрию проводят в закрытых кюветных отделениях фотометров, а хрупкие кюветы с плоскопараллельными стенкам – берегут от падений, царапин, потеков и капель. По той же причине, нельзя касаться руками оптических стенок кювет, а после употребления – их тщательно моют с мылом и хранят в дистилляте, высушив перед следующим измерением. Чтоб кюветы не запотевали, их заполняют растворами комнатной температуры до уровня, при котором поток света целиком проходит через раствор.

Диапазон электромагнитных волн

Известно, что видимый свет, лишь малая часть спектра электромагнитных излучений, чьи взаимно перпендикулярные электрическая и магнитная компоненты, периодически меняются местами. Поэтому энергию кванта (ε), частоту (ν) и длину их волн (λ) объединяют жесткие зависимости. В соответствии с ними, электромагнитный спектр условно делят на частично перекрывающиеся диапазоны, отчасти зависящие от источника излучений. Так, нет принципиальной разницы между волнами одной и той же длины в ИК и микроволновом диапазонах. Но, их называют ИК-лучам при генерации тепловым прибором и относят к микроволнам, если он электронный.

Применительно к химии и биологии важно, что энергия квантов излучений с λ < 1 нм, разрушает атомные ядра и химические связи, тогда как у волн длиной > 1000 нм, недостаточно энергии для изменений молекулярной структуры вещества. Поэтому основой идентификации веществ стали ИК и, реже УФ диапазоны. А в основу фоторецепции клеток и организмов, лег эволюционный отбор молекул красящих и зрительных фотопигментов, способных при поглощении квантов излучений промежуточной области, максимально изменять орбитали электронов, участвующих в образовании сопряженных двойных связей.

Как сказано выше, понятие свет относят к области электромагнитных волн в диапазоне 10-8-10-6 м. Человек и другие млекопитающие видят лишь в небольшой части спектра, соответственно длинам волн 380 – 800 нм.  рис. 1.

Видимый спектр

рис.1 Видимый спектр волн

Но, люди с удаленным хруcталиком, воспринимают УФ-диапазон, как и насекомые, которых привлекают, невзрачные для млекопитающих цветы. При том известно, что птицы – не видят в синей области спектра, ряд пресмыкающихся воспринимает ИК лучи, а летучие мыши и дельфины пользуются ультразвуковой эхолокацией.


Электрофороз биополимеров

Попытки деления смесей частиц с помощью электрофореза предпринимали с начала ХХ в. В основу их направленной, катодной или анодной подвижности, легли соответственно, отрицательный или положительный знак и целочисленные величины зарядов. К середине века, аппарат Тизелиуса стал основой электрофореза смесей белков. Он состоял из блока питания постоянного тока, стеклянной камеры с электродами, заполненной буферным раствором и довольно сложной оптики для визуальных наблюдений за делением фракций. Таким образом, вторым фактором деления смесей при свободном электрофорезе в растворе, стали величины рН и ионной силы буфера, изменяющие степень ионизации белков. Так, выбор стандартного рН 8,6 буферного раствора для белков сыворотки крови вызван тем, что в этом случае, все их фракции имеют катодную подвижность. К сожалению, приборы этой конструкции, имели ряд неустранимых недостатков, начиная с хрупкости и низкой разрешающей способности и, кончая высокой стоимостью.

В 1950 г. Durrum et al. предложили вести электрофорез белков сыворотки крови на полосках фильтровальной бумаги, пропитанных буфером. Этот тип электрофореза назвали зональным или зонным, т.к. поддержка среды-носителя ограничила диффузию компонентов смеси. Таким образом, свойства зоны, в качестве которой применяют хроматографическую бумагу, ацетилцеллюлозу, водные гели крахмала, агарозы и полиакриламида = ПАГ, стали третьим фактором деления смесей линейных биополимеров. Наконец, замена: стекла на пластиковые камеры разных конструкций и оптических систем прямого наблюдения на сравнительно простые вспомогательные приемы, резко удешевили конструкцию приборов, стандартизовав основные процедуры метода.

Таким образом, любой современный прибор для зонного электрофореза, как минимум включает в себя блок питания постоянного тока, обычно до 500 В и электрофоретическую камеру принципиально разных конструкций, зависящих от свойств зоны и выбора горизонтального, вертикального или других вариантов метода. До сих пор справедливо утверждение, что электрофорез – в основном аналитический метод.

Гель-хроматография

Принцип метода: Разделение смесей этим способом основано с одной стороны, на различиях в размерах их молекул, а с другой — на соизмеримости разделяемых молекул с размерами пор гранул гелей. Поэтому крупные макромолекулы в поры геля не проникают и элюируются с колонок первыми. Напротив, чем мельче размеры молекул других компонентов смеси, тем чаще они попадают через поры в гранулы и, задерживаясь в колонке, выходят из нее позже, то есть в больших объемах элюата. Отсюда синонимы метода: гель-фильтрация или метод молекулярных сит.

Свойства молекулярных сит имеют многие пористые материалы, начиная с природных или искусственных цеолитов, полиакриламида и пористого стекла, несжимаемых при гидростатическом давлении. Напротив, трехмерные гели агарозы и декстрана (коммерческие названия Сефадекс – Pharmacia, Швеция; Молселект – Reanal, Венгрия), благодаря высокому содержанию гидроксильных групп легко набухают, но и сжимаются при избытке давления или скорости истечения элюата, что нежелательно, во избежание регенерации колонки! Как правило, большие марки препаратов, идущих за их названием, отражают большую степень набухаемости и более крупный размер гранул, при меньшей степени их поперечной сшитости, позволяющих разделять вещества в широком диапазоне молекулярных масс.

Методы хроматографии

Известно, что основоположник хроматографии М. С. Цвет (1872 – 1919) разделил экстракт пигментов растений (1903) по их сорбции на колонке каолина = белой глины. Т.к. в потоке элюента = жидкости, фильтрующейся через носитель, скорости движения компонентов разделяемых смесей обратны степени их сорбции, Arne Tiselius (1902 – 1971, Швеция) предложил термин «сорбционный анализ» и, стал делить смеси, в зависимости от времени прохождения элюента через колонку или тонкий слой сорбента с развитой поверхностью.

При плоскостных методах, 1-10 мкл смеси разделяемых веществ наносят на бумагу или тонкий слой сорбента, закрепленный на стекле или фольге. Носитель помещают во влажную, чаще стеклянную камеру с элюентом — смесью двух частично смешивающихся жидкостей. За десятки минут элюент перемещается по сорбенту под действием капиллярных сил и гравитации. При этом одна из жидкостей фиксируется на сорбенте, образуя неподвижную фазу, а другая – подвижная, проходит по нему с большей скоростью. В соответствии со степенью растворимости в той или иной части элюента, компоненты смеси распределяются по хроматограмме.

Независимо от принципа деления компонентов, колоночная хроматография возможна вручную, но гораздо удобней специальные приборы – хроматографы. Обычно, при помощи насоса на вход их колонок подают, как разделяемую смесь, так и элюент. А на выходе – размещают детектор, который, независимо от конструкции, в автоматическом режиме непрерывно отражает на диаграмме регистрации = хроматограмме, время выхода и концентрации компонентов в элюате. Варианты колоночной хроматографии (рис. 8.1) отличаются друг от друга не так диаметром, длиной колонки и типом носителя, как очередностью подачи в нее элюента и разделяемой смеси. Преимущество проявительной хроматографии состоит в том, что колонка не требует регенерации, а зоны компонентов анализируемой смеси – разделяются слоями элюата.

В соответствии с агрегатным состоянием подвижной фазы, различают газо-жидкостную = ГЖХ и жидкостную хроматографию. Последняя – наиболее разнообразна, т.к. включает в себя фильтрацию в гелях, аффинную и высокоэффективную жидкостную хроматографию = ВЭЖХ, больше известную как HPLC = High pressure liquid chromatography, то есть хроматография под давлением. Т.о., все разнообразие методов хроматографии, как совокупности научных и производственных технологий в разных областях химии, медицины, экологии и т.д., основано на различиях в скоростях движения концентрационных зон компонентов изучаемых смесей, смещающихся относительно сорбента в потоке подвижной фазы.