Мембрана митохондрии двуслойна. Толщина мембран митохондрии равна 6—10 нм. Мембраны митохондрий на 70% состоят из белка. Фосфолипиды мембран представлены фосфатидтилхолином, фосфатидилэтаноламином, а также специфическими фосфолипидами, например, кардиолипином. Мембраны митохондрий не пропускают Н+ и служат барьером для их транспорта. Это важнейшее свойство лежит в основе образования электрохимического градиента.
Внутренняя мембрана дает выросты — кристы, расположенные перпендикулярно продольной оси органеллы и перегораживающие все внутреннее пространство митохондрий на отдельные отсеки. Однако, поскольку выросты-перегородки неполные, между этими отсеками сохраняется связь. Мембраны митохондрий обладают большой прочностью и гибкостью. Во внутренней мембране локализована дыхательная цепь (цепь переноса электронов). На внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий равномерно расположены грибовидные частицы. Каждая митохондрия содержит 104—105 таких грибовидных частиц, которые представляют собой фермент АТФ-синтазу, катализирующую образование АТФ.