Archive

Archive for the ‘Биохимия’ Category

Мерная химическая посуда

Понятием меры вместимости или мерная посуда, объединяют цилиндры, колбы, пипетки, мензурки, бюретки и др. из стекла и пластмасс, служащие для измерения объемов жидкостей. Основные достоинства этих измерительных сосудов – простота и легкость визуального контроля отмериваемых объемов по градуировке. Различают 2 вида калибровки мерной посуды: наливание и выливание. Из посуды для наливания: мерных колб и цилиндров, выливается меньше жидкости, чем отмерено, т.к. часть ее остается на внутренних стенках емкостей. Поэтому их используют, лишь для приготовления растворов точной концентрации. Для отмеривания точных объемов раствора, с последующим выливанием. они непригодны.

Цилиндры – сосуды цилиндрической формы и разного объема, с нанесенной на корпусе градуировкой и носиком или пришлифованной пробкой. Служат для отмеривания необходимых объемов растворов, но не их получения или смешивания!

цилиндры

Мерные колбы, чаще всего шаро- или грушевидной формы и разного объема, применяют для приготовления растворов точной концентрации. Обычно объем жидкости в мл указан на корпусе колбы и, там же проставлена температура, при которой ее калибровали. Объем, до которого колбу нужно наполнять, обозначен специальной круговой меткой = линией на ее горловине. Для приготовления растворов заданной концентрации или их разбавления, требуемое количество вещества (объем раствора) помещают в мерную колбу нужного объема и дополняют растворителем на 2/3 объема. Перемешав и растворив содержимое, объем колбы заполняют растворителем на 1-2 см ниже метки. Затем ее ставят повыше, чтобы метка оказалась на уровне глаз и, осторожно по каплям, из пипетки добавляют растворитель, пока нижняя часть мениска точно не коснется метки на горловине колбы. Плотно закрыв горловину колбы пробкой – перемешать содержимое.

мерные колбы

Приготовив раствор нужной концентрации, с помощью воронки его переносят в тару долговременного хранения, и, в зависимости от свойств растворенных веществ, размещают на полке для реактивов или в холодильнике.

Мерная посуда на выливание: пипетки и дозаторы – калибруется количеством вылитой из них жидкости.

Пипеткистеклянные или пластиковые трубки разного диаметра, с оттянутым носиком, предназначенные для дозирования относительно небольших объемов жидкости.

пипетки

Так называемые пипетки Мора (а) имеют прямой или расширенный корпус и используются для точных отмериваний объема. Они всегда рассчитаны на полный слив и поэтому, как и на мерных колбах, на них указана номинальная вместимость (мл), температура, при которой велась калибровка и в верхней части нанесена единственная круговая метка. Градуированные пипетки (б) – менее точны, но деления по всей длине корпуса позволяют дозировать жидкости отмеренными частями. Они бывают двух типов: с полным и неполным сливом. Поэтому, приступая к работе градуированной пипеткой, сначала определяют тип слива, затем – направление шкалы и, наконец, цену деления. Как видно из рисунка, отыскав нулевое деление шкалы, находят следующее деление, обозначенное цифрой и, подсчитывают число мелких штрихов между ними. Очевидно, что объем между 0 и 1 составляет 1 мл, а между ними находится 9 штрихов. Значит, цена делений приведенной шкалы = 0,1 мл.

шкала

Работая пипеткой, ее вертикально опускают в сосуд с жидкостью, используя для насасывания шланг с резиновой грушей или другим приспособлением. Отмеряя нужный объем, пипетку, как и мерную колбу, держат на уровне глаз, устанавливая нижнюю часть мениска точно на нулевой отметке. Пережав указательным пальцем шланг у верхнего отверстия пипетки с отмеренным объемом, ее кончик аккуратно переносят в нужную тару, регулируя силой нажатия пальца, скорость свободного истечения жидкости. Из пипеток с полным сливом, остаток жидкости не выдувают, а выпускают, коснувшись их носиком внутренней стенки тары. При неполном сливе, жидкость из пипетки выпускают до последней отметки объема, оставляя часть ее в носике.

Дозируя растворы пипетками, их соответственно помечают стеклографом или фломастером и размещают в гнездах специально маркированного штатива, строго соблюдая соответствие реактивам.

Закрыв склянку с реактивом соответствующей пробкой, пипетку возвращают в нужное гнездо штатива. ЗАПРЕЩАЕТСЯ: 1) Класть пипетки на поверхность столов; 2) Во избежание поломки или повреждений носика, прижимать пипетку с усилием ко дну сосуда, опускать в него свободным падением или перемешивать растворы. В последнем случае пользуются стеклянной палочкой, взбалтыванием, магнитной мешалкой или вортексом.

Пробирки узкие цилиндрические сосуды с дном округлой формы. Бывают разной величины и диаметра – простые (а), градуированные (б) и центрифужные (в), с конической нижней частью. Центрифужные градуированные пробирки, как правило, объемом 10 мл, позволяют после центрифугирования, сопоставить объемы осадка и надосадочной жидкости.


Химическая посуда общего назначения

К посуде общего назначения относят: стаканы, колбы, промывалки, чашки Петри, пробирки, воронки, стеклянные палочки и др., необходимые для полноценного химического анализа.

Стаканы – сосуды конической или цилиндрической формы и разной емкости, с носиком или без него, изготовленные из химически стойкого и тугоплавкого стекла равномерной толщины. Их используют как вспомогательную посуду для взбалтывания растворяемых веществ, нагрева, смешивания или слива растворов.

стакан

Колбы – сосуды разной формы и величины, горловина которых уже донной части. Обычно в лабораторной практике используют круглые (а) и конические (б) плоскодонные колбы разного объема, иногда со шлифом в горловине (в). Их применяют для растворения веществ, в т.ч. с нагревом и, смешивания растворов.

колбы

Промывалки – небольшие плоскодонные колбы, заполненные дистиллированной водой и закрытые пробкой с отверстиями, через которые пропущены 2 изогнутые стеклянные трубки. Одна из них служит для создания в колбе избыточного давления, а вторая – для вывода жидкости. Служат для смыва осадков со стенок сосудов и промывки кювет. Гораздо практичней самодельные промывалки из мягких пластиковых флаконов.

Промывалка

Чашки Петри – круглые, толстостенные плоскодонные, с крышкой. Служат для выращивания биологических культур, круговой хроматографии на бумаге и выпаривания небольших количеств жидкости лишь при комнатной температуре.

Петри


Из чего складывается пищевая ценность белка

Состояние белкового обмена целостного организма зависит не только от количества принимаемого с пищей белка, но и от качественного состава его. В опытах на животных было показано, что получение одинакового количества разных пищевых белков сопровождается в ряде случаев развитием отрицательного азотистого баланса. Так, скармливание равного количества казеина и желатина крысам приводило к положительному азотистому балансу в первом случае и к отрицательному — во втором. Имел значение различный аминокислотный состав белков, что послужило основанием для предположения о существовании в природе якобы «неполноценных» белков. Оказалось, что из 20 аминокислот в желатине почти отсутствуют (или содержатся в малых количествах) валин, тирозин, метионин и цистеин; кроме того, желатин характеризуется другим, отличным от казеина процентным содержанием отдельных аминокислот. Этим можно объяснить тот факт, что замена в питании крыс казеина на желатин приводит к развитию отрицательного азотистого баланса. Приведенные данные свидетельствуют о том, что различные белки обладают неодинаковой пищевой ценностью. Поэтому для удовлетворения пластических потребностей организма требуются достаточные количества разных белков пищи. По-видимому, справедливо положение, что, чем ближе аминокислотный состав принимаемого пищевого белка к аминокислотному составу белков тела, тем выше его биологическая ценность. Следует, однако, отметить, что степень усвоения пищевого белка зависит также от эффективности его распада под влиянием ферментов желудочно-кишечного тракта. Ряд белковых веществ (например, белки шерсти, волос, перьев и др.), несмотря на их близкий аминокислотный состав к белкам тела человека, почти не используются в качестве пищевого белка, поскольку они не гидролизуются протеиназами кишечника человека и большинства животных.

С понятием биологической ценности белков тесно связан вопрос об эссенциальных (незаменимых) аминокислотах. Живые организмы существенно различаются в зависимости от их способности синтезировать аминокислоты или другие азотсодержащие соединения, которые они могут использовать для биосинтеза аминокислот. Высшие растения, например, могут синтезировать все необходимые для белкового синтеза аминокислоты, причем могут использовать для этого аммиак или нитраты в качестве источника азота. Микроорганизмы обладают различной способностью синтезировать аминокислоты. В частности, если Е. coli синтезирует все аминокислоты, используя нитриты и нитраты или аммиак, то молочнокислые бактерии не обладают этой способностью и получают аминокислоты в готовом виде из молока. Высшие позвоночные животные не синтезируют все необходимые аминокислоты. В организме человека и белых крыс синтезируются только 10 из 20 необходимых аминокислот — так называемые заменимые аминокислоты. Они могут быть синтезированы из продуктов обмена углеводов и липидов. Ещё 2 называются частично заменимыми — они могут быть синтезированы из другой аминокислоты, и частично теряют свою важность в процессе онтогенеза — это аргинин и гистидин. Остальные 8 аминокислот не синтезируются в организме, поэтому они были названы жизненно необходимыми — эссенциальными, или незаменимыми аминокислотами.

Незаменимость аминокислот для роста и развития организма человека объясняется отсутствием способности клеток синтезировать углеродные скелеты незаменимых аминокислот, поскольку процесс аминирования соответствующих кетопроизводных осуществляется сравнительно легко посредством реакций трансаминирования. Следовательно, для обеспечения нормальной жизнедеятельности человека и животных все эти 10 аминокислот должны поступать с пищей.

Следует напомнить, что для взрослого человека аргинин и гистидин оказались частично заменимыми. Г. Роуз наблюдал людей, получавших искусственную пищу, в которой белок был полностью заменен смесью 20 аминокислот. Он установил, что для сохранения нормальной массы тела и работоспособности имеют значение не только определенное количество каждой аминокислоты и соотношение незаменимых аминокислот в подобной диете, но и содержание в последней общего азота.

Исключение какой-либо незаменимой аминокислоты из пищевой смеси сопровождается развитием отрицательного азотистого баланса, истощением, остановкой роста, нарушениями функции нервной системы и др. В опытах на крысах были установлены следующие величины незаменимых аминокислот, необходимых для оптимального роста, относительно триптофана, принятого за единицу: лизина 5; лейцина 4; валина 3,5; фенил-аланина 3,5; метионина 3; изолейцина 2,5; треонина 2,5; гистидина 2; аргинина 1. Имеются доказательства, что примерно такое же соотношение незаменимых аминокислот требуется для человека.

Пищевой белок и продукты питания

В настоящее время качество пищевых белков оценивают по коэффициенту их усвоения. Он учитывает аминокислотный состав (химическую ценность) и полноту переваривания (биологическую ценность) белков. Продукты, имеющие коэффициент усвоения равный 1,0, являются наиболее полноценными источниками белка.

Высококачественными белковыми продуктами являются молоко, яйца и мясо, которые, к сожалению, часто содержат довольно много жира, поэтому необходимо помнить, что при наличии даже небольшого количества жира следует ограничить себя в излишнем потреблении калорий.

Предпочтительные белковые продукты: нежирные сыры, обезжиренный творог, яичный белок, большинство свежей рыбы и морепродукты, нежирная телятина, молодой барашек, куры, индейка, предпочтительно белое мясо без кожицы, соевое мясо, соевое молоко или соевые сыры (тофу).

Менее предпочтительные продукты: темное мясо кур и индеек, домашний творог, нежирная нарезка холодного копчения, красное мясо (вырезка), переработанное мясо: бекон, салями, ветчина, молоко и йогурты с сахаром.

Яичный белок представляет собой чистый белок, лишенный жира. Постное мясо содержит в себе около 50 % калорий, приходящихся на долю белков, снятое (обезжиренное) молоко — 40 %, овощи — около 30 % и содержащие крахмалы продукты — около 15 %.

Лучше усваиваются белки, подвергнутые тепловой обработке, так как они становятся более доступными для ферментов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Однако, тепловая обработка может снижать биологическую ценность белка из-за разрушения некоторых аминокислот.

История развития методологии белков

До 70-х гг. прошлого века, наиболее точным (10-5 г/л), считалось определение белка по количеству азота. Исходя из того, что в подавляющем большинстве белков, за исключением гистонов и протаминов, содержание азота близко к 16 %, считалось достаточным умножить найденную величину на эмпирический коэффициент 6,25 и, получить содержание белка в препарате. Однако, необходимость минерализации препарата в серной кислоте и последующее определение аммиака, занимали часы-сутки. Из-за длительности и трудоемкости этих процедур, сейчас этот метод применяют редко. По близким причинам, измерение концентраций белка на основе анализа аминокислот, используют лишь в специализированных лабораториях.

С 50-х гг. ХХ в., чаще всего в биохимической литературе цитировали работу Lowry и соавторов, предложивших измерять концентрации белков сочетанием биуретовой реакции с реактивом Фолина-Чиокалто (1927), дающим интенсивную темно-синюю окраску с тирозином, фенилаланином и, меньше с такими аминокислотами, как Три, Гис, Цис. К сожалению, его линейность, сохраняется лишь в узком диапазоне концентраций. Большинство модификаций этой методики сводится к попыткам устранить влияние специфических реагентов, применявшихся при выделении белков. В последние годы появились методы связывания красителей и флуорометрии, если в белке имеется, или, без потери нативных свойств, в него вводится соответствующий маркер.

Классификация мктодов определения белка в биологической жидкости

Известно, что белки составляют половину и более сухой массы большинства клеток. Пластичность их полипептидной структуры позволяет белкам играть роль главных «молекулярных машин» в любой клетке и организме. Наконец белки – важнейший источник азота в питании, а, следовательно, росте и развитии консументов. Поэтому определение белка играет первичную = опорную роль во всех количественных исследованиях по энзимологии и биологии клеток, служит основой оценки физиологии и патологии организмов и их популяций, а также – важнейшим критерием оценки качества = эффективности пищевых цепей.

Соответственно задачам и возможностям лабораторий, методы измерения концентрации белков многочисленны и разнообразны. Очевидно, что рефрактометрия (лат. Refractus – преломление) позволяет быстро и просто определять процентные концентрации белка в двухкомпонентных растворах. Гравиметрия – зависит от чувствительности лабораторных весов и требует чистого препарата, высушенного до постоянной массы.

Методы измерения концентрации белков:

1.Непрямые:1)определение азота,2)аминокислотный анализ,3)метод Лоури,4)Флуорометия и сорбция красителей.

2. Прямые:1) рефрактометрия,2) гравиметрия,3) спектрофотометрия,4) Биуретовый.

Фотоспектрометрия

Фотометрический анализ – совокупность методов качественного и количественного анализа по интенсивности УФ, видимого и ИК излучений. Но, т.к. биообъекты на 2/3 состоят из воды, высокая теплоемкость которой поглощает ИК лучи, то в биологии их почти не применяют, широко используя 2 других диапазона

Нередко фотометрию сводят к молекулярно-абсорбционному анализу, основанному на объединенном законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера. Согласно ему, в стандартных условиях кюветного отделения и длины волны, перпендикулярной толщине слоя однородной среды (l), между концентрацией (С) поглощающего вещества и соотношением интенсивностей исходного = Ф0 и достигшего детектора = Ф1 потоков излучений, возникает логарифмическая зависимость: С = lg Ф01. Отсюда появился не очень точный, но распространенный синоним – концентрационный анализ.

При стандартных λ и толщине образца, количество света достигшее фотодетектора выражают линейной шкалой светопропускания = Т (transition), которую для удобства в работе, обычно градуируют в %. К сожалению, она не имеет прямого отношения к свойствам образца, ослабляющего интенсивность излучений за счет поглощения = А (absorbtion) или, таких устаревших понятий, как оптическая плотность = D (density) раствора и коэффициент его экстинкции = Е. С другой стороны, зависимость 2 – lg T = А, обеспечивает высокую точность измерения концентраций в диапазоне 0,2-0,8 безразмерной логарифмической шкалы от 0 до ∞.

Во избежание оптических эффектов, способных исказить результаты, фотометрию проводят в закрытых кюветных отделениях фотометров, а хрупкие кюветы с плоскопараллельными стенкам – берегут от падений, царапин, потеков и капель. По той же причине, нельзя касаться руками оптических стенок кювет, а после употребления – их тщательно моют с мылом и хранят в дистилляте, высушив перед следующим измерением. Чтоб кюветы не запотевали, их заполняют растворами комнатной температуры до уровня, при котором поток света целиком проходит через раствор.

Диапазон электромагнитных волн

Известно, что видимый свет, лишь малая часть спектра электромагнитных излучений, чьи взаимно перпендикулярные электрическая и магнитная компоненты, периодически меняются местами. Поэтому энергию кванта (ε), частоту (ν) и длину их волн (λ) объединяют жесткие зависимости. В соответствии с ними, электромагнитный спектр условно делят на частично перекрывающиеся диапазоны, отчасти зависящие от источника излучений. Так, нет принципиальной разницы между волнами одной и той же длины в ИК и микроволновом диапазонах. Но, их называют ИК-лучам при генерации тепловым прибором и относят к микроволнам, если он электронный.

Применительно к химии и биологии важно, что энергия квантов излучений с λ < 1 нм, разрушает атомные ядра и химические связи, тогда как у волн длиной > 1000 нм, недостаточно энергии для изменений молекулярной структуры вещества. Поэтому основой идентификации веществ стали ИК и, реже УФ диапазоны. А в основу фоторецепции клеток и организмов, лег эволюционный отбор молекул красящих и зрительных фотопигментов, способных при поглощении квантов излучений промежуточной области, максимально изменять орбитали электронов, участвующих в образовании сопряженных двойных связей.

Как сказано выше, понятие свет относят к области электромагнитных волн в диапазоне 10-8-10-6 м. Человек и другие млекопитающие видят лишь в небольшой части спектра, соответственно длинам волн 380 – 800 нм.  рис. 1.

Видимый спектр

рис.1 Видимый спектр волн

Но, люди с удаленным хруcталиком, воспринимают УФ-диапазон, как и насекомые, которых привлекают, невзрачные для млекопитающих цветы. При том известно, что птицы – не видят в синей области спектра, ряд пресмыкающихся воспринимает ИК лучи, а летучие мыши и дельфины пользуются ультразвуковой эхолокацией.


Электрофороз биополимеров

Попытки деления смесей частиц с помощью электрофореза предпринимали с начала ХХ в. В основу их направленной, катодной или анодной подвижности, легли соответственно, отрицательный или положительный знак и целочисленные величины зарядов. К середине века, аппарат Тизелиуса стал основой электрофореза смесей белков. Он состоял из блока питания постоянного тока, стеклянной камеры с электродами, заполненной буферным раствором и довольно сложной оптики для визуальных наблюдений за делением фракций. Таким образом, вторым фактором деления смесей при свободном электрофорезе в растворе, стали величины рН и ионной силы буфера, изменяющие степень ионизации белков. Так, выбор стандартного рН 8,6 буферного раствора для белков сыворотки крови вызван тем, что в этом случае, все их фракции имеют катодную подвижность. К сожалению, приборы этой конструкции, имели ряд неустранимых недостатков, начиная с хрупкости и низкой разрешающей способности и, кончая высокой стоимостью.

В 1950 г. Durrum et al. предложили вести электрофорез белков сыворотки крови на полосках фильтровальной бумаги, пропитанных буфером. Этот тип электрофореза назвали зональным или зонным, т.к. поддержка среды-носителя ограничила диффузию компонентов смеси. Таким образом, свойства зоны, в качестве которой применяют хроматографическую бумагу, ацетилцеллюлозу, водные гели крахмала, агарозы и полиакриламида = ПАГ, стали третьим фактором деления смесей линейных биополимеров. Наконец, замена: стекла на пластиковые камеры разных конструкций и оптических систем прямого наблюдения на сравнительно простые вспомогательные приемы, резко удешевили конструкцию приборов, стандартизовав основные процедуры метода.

Таким образом, любой современный прибор для зонного электрофореза, как минимум включает в себя блок питания постоянного тока, обычно до 500 В и электрофоретическую камеру принципиально разных конструкций, зависящих от свойств зоны и выбора горизонтального, вертикального или других вариантов метода. До сих пор справедливо утверждение, что электрофорез – в основном аналитический метод.

Гель-хроматография

Принцип метода: Разделение смесей этим способом основано с одной стороны, на различиях в размерах их молекул, а с другой — на соизмеримости разделяемых молекул с размерами пор гранул гелей. Поэтому крупные макромолекулы в поры геля не проникают и элюируются с колонок первыми. Напротив, чем мельче размеры молекул других компонентов смеси, тем чаще они попадают через поры в гранулы и, задерживаясь в колонке, выходят из нее позже, то есть в больших объемах элюата. Отсюда синонимы метода: гель-фильтрация или метод молекулярных сит.

Свойства молекулярных сит имеют многие пористые материалы, начиная с природных или искусственных цеолитов, полиакриламида и пористого стекла, несжимаемых при гидростатическом давлении. Напротив, трехмерные гели агарозы и декстрана (коммерческие названия Сефадекс – Pharmacia, Швеция; Молселект – Reanal, Венгрия), благодаря высокому содержанию гидроксильных групп легко набухают, но и сжимаются при избытке давления или скорости истечения элюата, что нежелательно, во избежание регенерации колонки! Как правило, большие марки препаратов, идущих за их названием, отражают большую степень набухаемости и более крупный размер гранул, при меньшей степени их поперечной сшитости, позволяющих разделять вещества в широком диапазоне молекулярных масс.